La edición del genoma o edición genómica, también conocida
como edición genética es un tipo de ingeniería genética en la que se realiza la
manipulación, modificación o alteración directa de una secuencia de ADN en el
genoma de una célula u organismo ya sea eliminando, insertando o reemplazando
alguna secuencia de interés en su genotipo.
La edición del genoma también se refiere a un tipo de
ingeniería genética por la cual secuencias del genoma pueden ser directamente
manipuladas para crear un organismo genéticamente modificado.
Durante los últimos años se han desarrollado métodos para la
edición del genoma de una manera precisa y ágil, actualmente se conocen tres
métodos para realizar la edición de un genoma: ZNF, TALEN y CRISPR.
Los tres métodos aprovechan una cualidad que tienen todas
sus células, consistente en reparar el ADN cuando se rompen las dos cadenas que
lo conforman.
Las metodologías de edición genómica desarrolladas hasta el
momento se basan en la generación de un corte en las dos hebras de la doble
hélice del ADN (llamado corte doble cadena, o “double strand break”, DSB)
realizado en forma precisa y dirigida en la región a editar. Este corte es
luego reparado por la célula que dispone, para esto, de dos mecanismos
alternativos:
Unión de extremos no
homólogos
Es la vía de reparación preferencial, consiste en la
recombinación no homóloga o unión de extremos no homólogos (cuya sigla en
inglés es NHEJ por “Non-homologous end-joining”). Este mecanismo consiste en la
simple unión de los extremos generados y típicamente introduce mutaciones
adicionales al generar inserciones o selecciones en la zona de la unión. Lo que
hace la célula es pegar a los extremos rotos del ADN unas proteínas
específicas, las cuales se unen entre sí para acercar los extremos fracturados
y pegarlos nuevamente; en caso de que sea necesario, incluso puede añadir unos
cuantos nucleótidos —moléculas que son las unidades básicas de la estructura
del ADN y el ARN— para resanar la fractura, acción que suele dejar una
“cicatriz” (mutación) en el lugar de la unión.
Reparación asistida
por plantilla
La segunda opción se utiliza cuando el cromosoma se rompe
pero existe un segmento adicional de ADN que es idéntico en secuencia a uno y
otro lado de la fractura; la célula utiliza este segmento como guía fiel para
reparar el ADN. Esta vía también es llamada recombinación homóloga (cuya sigla
en inglés es HR o HDR por “Homologous recombination” o “Homology-directed
repair”) que puede utilizar como molde la región correspondiente del cromosoma
homólogo o una molécula exógena de ADN provista para llevar a cabo la correcta
unión de los extremos. El cromosoma así editado es luego heredado por las
células hijas.
TIJERAS MOLECULARES
El diseño de las tijeras moleculares programables fue un triunfo de la ingeniería genética.
Cada sistema de edición tiene su propio mecanismo de
programación: en los sistemas ZFN y TALEN la misma proteína que actúa como
tijera es la que se programa para que corte en un sitio predefinido.
En contraste, el sistema CRISPR/Cas9 tiene dos componentes
independientes: La proteína Cas9 que actúa como tijera y un pequeño ARN guía
que le dice a Cas9 dónde ejercer su acción. La gran belleza de este último
sistema radica en que programar un ARN es muchísimo más fácil que programar una
proteína, razón por la cual en la actualidad es el método que goza de mayor
prestigio.
MÉTODO ZNF
Las nucleasas con dedos de zinc (ZFN, del inglés “zinc-finger nucleases”) son enzimas de restricción artificiales creadas a partir de la fusión del dominio dedo de zinc de unión al ADN con un dominio de ruptura de ADN.
Los dedos de zinc pueden ser modificados para reconocer
secuencias de ADN específicas que permitan a las nucleasas con dedos de zinc
procesar secuencias únicas en un genoma completo.
Aprovechándose de la maquinaria de reparación de ADN
endógena, se pueden usar estos reactivos para modificar el genoma de organismos
superiores. Esta característica las convierte en una valiosa herramienta para
la biología molecular, que consiste en revertir mutaciones que causan
enfermedades. Se pueden modificar los dedos de zinc de forma que reconozcan una
secuencia específica cercana a la mutación causante de la enfermedad e
introducir una secuencia silvestre sin la mutación en la célula.
La nucleasa corta en las dos cadenas de ADN y usa la
secuencia silvestre como molde para la reparación celular mediante
recombinación homóloga. Las ventajas de utilizar las nucleasas con dedos de
zinc para esta finalidad son que reparan la secuencia del gen sin integrar
ninguna secuencia en el genoma, la eficiencia es muy alta y no es necesario
mantener la expresión de un gen a lo largo del tiempo. Sin embargo, también
presentan inconvenientes, puesto que probablemente sólo puedan aplicarse a
terapias ex vivo, tengan alto poder inmunogénico y produzcan efectos
secundarios, ya que aún queda por demostrar su inocuidad.
MÉTODO TALEN
TALEN, siglas en inglés de “Transcription activator-like
effector nuclease”, traducible al español como «nucleasa de actividad similar a
activador de transcripción», es el nombre de una clase de enzimas de
restricción que pueden diseñarse artificialmente para cortar una secuencia
específica de ADN.
Se construyen mediante la fusión de un efector tipo TAL y
un dominio cortador del ADN (una nucleasa que corta hebras de ADN). Los
efectores TAL —TALEs— pueden diseñarse para ser capaces de unirse a
prácticamente cualquier secuencia de ADN, por lo que al unirse a una nuclaeasa,
el ADN se puede cortar en lugares específicos.
Las enzimas de restricción pueden introducirse en células,
para su uso en edición génica o para la edición de genoma in situ, técnica
conocida como edición genómica mediada por nucleasas.
MÉTODO CRISPR
Los CRISPR (en inglés “clustered regularly interspaced short
palindromic repeats”, en español repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y
regularmente interespaciadas) son familias de secuencias de ADN en bacterias.
Las secuencias contienen fragmentos de ADN de virus que han
atacado a las bacterias. Estos fragmentos son utilizados por la bacteria para
detectar y destruir el ADN de nuevos ataques de virus similares, y así poder
defenderse eficazmente de ellos.
En términos más técnicos son “loci” de ADN que contienen
repeticiones cortas de secuencias de bases. Tras cada repetición siguen
segmentos cortos de "ADN espaciador" proveniente de exposiciones
previas a un virus. Se encuentran en aproximadamente el 40% de los genomas
bacterianos y en el 90% de los genomas secuenciados de las arqueas. Con
frecuencia se hallan asociados con los genes Cas, que codifican para proteínas
nucleasas relacionadas con los CRISPR. El sistema CRISPR/Cas es un sistema
inmunitario procariótico que confiere resistencia a agentes externos como
plásmidos y fagos y provee una forma de inmunidad adquirida. Los espaciadores
de los CRISPR reconocen secuencias específicas y guían a las nucleasas Cas para
cortar y degradar esos elementos génicos exógenos de una manera análoga al ARNi
en sistemas eucarióticos.
Con mucho es la técnica más usual en la edición genética.
CRISP/Cas9
Desde 2013 el sistema CRISPR/Cas se ha utilizado para la
edición de genes (agregando, interrumpiendo o cambiando las secuencias de genes
específicos) y para la regulación génica en varias especies.
Cas9 es una nucleasa, una enzima especializada en cortar
ADN, con dos sitios de corte activos (HNH y RuvC), uno para cada hebra de la
doble hélice.
Al administrar la proteína Cas9 y los ARN guías apropiados a
una célula, el genoma de esta puede cortarse en los lugares deseados, cuyas
secuencias serán complementarias a las de los ARN guías utilizados. Esto
permite la eliminación funcional de genes o la introducción de mutaciones (tras
la reparación del corte realizado por la maquinaria celular de reparación del
ADN) para estudiar sus efectos. Modificaciones recientes del sistema
CRISPR/Cas9 permiten también actuar sobre la transcripción de los genes,
modificando así solo su nivel de funcionamiento, pero no la información
genética.
Adicionalmente, CRISPR ha sido modificada para hacer
factores de transcripción programables que permiten a los científicos silenciar
o activar ciertos genes. Existe ahora librerías con decenas de miles de ARN
guía. Quizá puedan usarse los CRISPRs para construir sistemas de entrega de
genes guiados por ARN que lleguen a alterar los genomas de poblaciones enteras.
Actualmente se utilizan gran cantidad de nucleasas diferentes
a Cas9.
Así Cas12a (anteriormente Cpf1) descrita en 2015 que mostró
varias diferencias claves de Cas9 incluyendo: causando un corte 'escalonado' en
el ADN de doble hebra, en oposición al corte 'brusco' producido por Cas9
CasΦ Se trata de una nucleasa hipercompacta descrita en 2020
que representa la mitad del peso molecular de Cas9/Cas12 y con características
similares en su utilización como herramienta para la edición génica.
MECANISMO DE EDICIÓN
• Comienza con el diseño de una molécula de ARN (CRISPR o ARN guía).
•
Es insertada en una célula.
•
Una vez dentro reconoce el sitio exacto del
genoma donde la enzima Cas9 deberá cortar.
•
Incluye dos etapas.
•
En la primer atapa el ARN guía se asocia con la
enzima Cas9. Este ARN guía es específico por
complementariedad y se hibridará en esa secuencia (la que nos interesa editar
o corregir). Entonces actúa Cas9, que es una enzima endonucleasa cortando el ADN.
Básicamente podemos decir que el ARN guía actúa de perro lazarillo llevando a
Cas9, el ejecutor, al sitio donde ha de realizar su función.
•
En la segunda etapa se activan al menos dos
mecanismos naturales de reparación del ADN cortado. El primero llamado indel (inserción-deleción)
hace que, después del sitio de corte aparezca un hueco en la cadena o se
inserte un trocito más de cadena. Esto conlleva a la perdida de la función
original del segmento de ADN cortado. Un segundo mecanismo permite la incorporación
de una secuencia concreta exactamente en el sitio original de corte. Para esto, lógicamente, hemos de darle a la
célula la secuencia que queremos que se integre en el ADN.
CRISP/Cas13
Supone una edición de bases del ARN. Interviene Cas13, una
enzima que actúa sobre el ARN, en lugar de la habitual Cas9, que actúa en el ADN.
Los avances recientes han llevado al revelado del sistema
CRISPR-Cas13, que actúa sobre el ARN mensajero. Puesto que las claves del ARN
para la serie de los ácidos nucleicos producidos, corrigiendo la serie del ARN
pueden por lo tanto corregir temporalmente la expresión génica sin los riesgos
serios asociados a los cambios permanentes al genoma.
Esto se podía utilizar en el tratamiento de enfermedades
agudas y la reducción temporal en la inflamación durante el trasplante del
órgano. Además de los papeles terapéuticos posibles, el sistema CRISPR-Cas13
puede también ofrecer discernimientos en el ARN que tramita en enfermedad, por
ejemplo ARN que corrige y que empalma alternativo.
Puesto que los cambios a los niveles del gen son solamente
transitorios, éste permite que los científicos investiguen el gen posible
golpea las salidas que podrían curar enfermedad. Los niveles del ARN se pueden
volver a normal una vez que el sistema CRISPR-Cas13 se quita de la célula.
Debido a esto los cambios no serían pasados sobre los descendientes.
El modo de actuación es:
• Convierte
una adenina (A) en inosina (I), la cual es interpretada como guanina (G) por la
maquinaria celular de síntesis de proteínas.
• Ello
permite reparar temporalmente una mutación causante de una enfermedad sin
alterar de forma permanente el genoma.
• Opción
que puede resultar más segura, cuando se trata de terapias correctoras de
genes.
• Aunque,
implicaría administrar el tratamiento de modo repetido.
