EDICIÓN DEL GENOMA

 

La edición del genoma o edición genómica, también conocida como edición genética es un tipo de ingeniería genética en la que se realiza la manipulación, modificación o alteración directa de una secuencia de ADN en el genoma de una célula u organismo ya sea eliminando, insertando o reemplazando alguna secuencia de interés en su genotipo.

La edición del genoma también se refiere a un tipo de ingeniería genética por la cual secuencias del genoma pueden ser directamente manipuladas para crear un organismo genéticamente modificado.

Durante los últimos años se han desarrollado métodos para la edición del genoma de una manera precisa y ágil, actualmente se conocen tres métodos para realizar la edición de un genoma: ZNF, TALEN y CRISPR.

Los tres métodos aprovechan una cualidad que tienen todas sus células, consistente en reparar el ADN cuando se rompen las dos cadenas que lo conforman.

Las metodologías de edición genómica desarrolladas hasta el momento se basan en la generación de un corte en las dos hebras de la doble hélice del ADN (llamado corte doble cadena, o “double strand break”, DSB) realizado en forma precisa y dirigida en la región a editar. Este corte es luego reparado por la célula que dispone, para esto, de dos mecanismos alternativos:

Unión de extremos no homólogos

Es la vía de reparación preferencial, consiste en la recombinación no homóloga o unión de extremos no homólogos (cuya sigla en inglés es NHEJ por “Non-homologous end-joining”). Este mecanismo consiste en la simple unión de los extremos generados y típicamente introduce mutaciones adicionales al generar inserciones o selecciones en la zona de la unión. Lo que hace la célula es pegar a los extremos rotos del ADN unas proteínas específicas, las cuales se unen entre sí para acercar los extremos fracturados y pegarlos nuevamente; en caso de que sea necesario, incluso puede añadir unos cuantos nucleótidos —moléculas que son las unidades básicas de la estructura del ADN y el ARN— para resanar la fractura, acción que suele dejar una “cicatriz” (mutación) en el lugar de la unión.

Reparación asistida por plantilla

La segunda opción se utiliza cuando el cromosoma se rompe pero existe un segmento adicional de ADN que es idéntico en secuencia a uno y otro lado de la fractura; la célula utiliza este segmento como guía fiel para reparar el ADN. ​Esta vía también es llamada recombinación homóloga (cuya sigla en inglés es HR o HDR por “Homologous recombination” o “Homology-directed repair”) que puede utilizar como molde la región correspondiente del cromosoma homólogo o una molécula exógena de ADN provista para llevar a cabo la correcta unión de los extremos.​ El cromosoma así editado es luego heredado por las células hijas.

TIJERAS MOLECULARES

El diseño de las tijeras moleculares programables fue un triunfo de la ingeniería genética.

Cada sistema de edición tiene su propio mecanismo de programación: en los sistemas ZFN y TALEN la misma proteína que actúa como tijera es la que se programa para que corte en un sitio predefinido.

En contraste, el sistema CRISPR/Cas9 tiene dos componentes independientes: La proteína Cas9 que actúa como tijera y un pequeño ARN guía que le dice a Cas9 dónde ejercer su acción. La gran belleza de este último sistema radica en que programar un ARN es muchísimo más fácil que programar una proteína, razón por la cual en la actualidad es el método que goza de mayor prestigio.

MÉTODO ZNF

Las nucleasas con dedos de zinc (ZFN, del inglés “zinc-finger nucleases”) son enzimas de restricción artificiales creadas a partir de la fusión del dominio dedo de zinc de unión al ADN con un dominio de ruptura de ADN.

Los dedos de zinc pueden ser modificados para reconocer secuencias de ADN específicas que permitan a las nucleasas con dedos de zinc procesar secuencias únicas en un genoma completo.

Aprovechándose de la maquinaria de reparación de ADN endógena, se pueden usar estos reactivos para modificar el genoma de organismos superiores. Esta característica las convierte en una valiosa herramienta para la biología molecular, que consiste en revertir mutaciones que causan enfermedades. Se pueden modificar los dedos de zinc de forma que reconozcan una secuencia específica cercana a la mutación causante de la enfermedad e introducir una secuencia silvestre sin la mutación en la célula.

La nucleasa corta en las dos cadenas de ADN y usa la secuencia silvestre como molde para la reparación celular mediante recombinación homóloga. Las ventajas de utilizar las nucleasas con dedos de zinc para esta finalidad son que reparan la secuencia del gen sin integrar ninguna secuencia en el genoma, la eficiencia es muy alta y no es necesario mantener la expresión de un gen a lo largo del tiempo. Sin embargo, también presentan inconvenientes, puesto que probablemente sólo puedan aplicarse a terapias ex vivo, tengan alto poder inmunogénico y produzcan efectos secundarios, ya que aún queda por demostrar su inocuidad.

MÉTODO TALEN

TALEN, siglas en inglés de “Transcription activator-like effector nuclease”, traducible al español como «nucleasa de actividad similar a activador de transcripción», es el nombre de una clase de enzimas de restricción que pueden diseñarse artificialmente para cortar una secuencia específica de ADN.

​ Se construyen mediante la fusión de un efector tipo TAL y un dominio cortador del ADN (una nucleasa que corta hebras de ADN). Los efectores TAL —TALEs— pueden diseñarse para ser capaces de unirse a prácticamente cualquier secuencia de ADN, por lo que al unirse a una nuclaeasa, el ADN se puede cortar en lugares específicos.

Las enzimas de restricción pueden introducirse en células, para su uso en edición génica o para la edición de genoma in situ, técnica conocida como edición genómica mediada por nucleasas.

 

MÉTODO CRISPR

Los CRISPR (en inglés “clustered regularly interspaced short palindromic repeats”, en español repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas​) son familias de secuencias de ADN en bacterias.

Las secuencias contienen fragmentos de ADN de virus que han atacado a las bacterias. Estos fragmentos son utilizados por la bacteria para detectar y destruir el ADN de nuevos ataques de virus similares, y así poder defenderse eficazmente de ellos.

En términos más técnicos son “loci” de ADN que contienen repeticiones cortas de secuencias de bases. Tras cada repetición siguen segmentos cortos de "ADN espaciador" proveniente de exposiciones previas a un virus. ​ Se encuentran en aproximadamente el 40% de los genomas bacterianos y en el 90% de los genomas secuenciados de las arqueas.​ Con frecuencia se hallan asociados con los genes Cas, que codifican para proteínas nucleasas relacionadas con los CRISPR. El sistema CRISPR/Cas es un sistema inmunitario procariótico que confiere resistencia a agentes externos como plásmidos y fagos​ y provee una forma de inmunidad adquirida. Los espaciadores de los CRISPR reconocen secuencias específicas y guían a las nucleasas Cas para cortar y degradar esos elementos génicos exógenos de una manera análoga al ARNi en sistemas eucarióticos. ​

Con mucho es la técnica más usual en la edición genética.

CRISP/Cas9

Desde 2013 el sistema CRISPR/Cas se ha utilizado para la edición de genes (agregando, interrumpiendo o cambiando las secuencias de genes específicos) y para la regulación génica en varias especies.

​ Cas9 es una nucleasa, una enzima especializada en cortar ADN, con dos sitios de corte activos (HNH y RuvC), uno para cada hebra de la doble hélice.

Al administrar la proteína Cas9 y los ARN guías apropiados a una célula, el genoma de esta puede cortarse en los lugares deseados, cuyas secuencias serán complementarias a las de los ARN guías utilizados. Esto permite la eliminación funcional de genes o la introducción de mutaciones (tras la reparación del corte realizado por la maquinaria celular de reparación del ADN) para estudiar sus efectos. Modificaciones recientes del sistema CRISPR/Cas9 permiten también actuar sobre la transcripción de los genes, modificando así solo su nivel de funcionamiento, pero no la información genética.

Adicionalmente, CRISPR ha sido modificada para hacer factores de transcripción programables que permiten a los científicos silenciar o activar ciertos genes. Existe ahora librerías con decenas de miles de ARN guía. Quizá puedan usarse los CRISPRs para construir sistemas de entrega de genes guiados por ARN que lleguen a alterar los genomas de poblaciones enteras.

Actualmente se utilizan gran cantidad de nucleasas diferentes a Cas9.

Así Cas12a (anteriormente Cpf1) descrita en 2015 que mostró varias diferencias claves de Cas9 incluyendo: causando un corte 'escalonado' en el ADN de doble hebra, en oposición al corte 'brusco' producido por Cas9

CasΦ Se trata de una nucleasa hipercompacta descrita en 2020 que representa la mitad del peso molecular de Cas9/Cas12 y con características similares en su utilización como herramienta para la edición génica.

MECANISMO DE EDICIÓN

      •       Comienza con el diseño de una molécula de ARN (CRISPR o ARN guía).

•       Es insertada en una célula.

•       Una vez dentro reconoce el sitio exacto del genoma donde la enzima Cas9 deberá cortar.

•       Incluye dos etapas.

•       En la primer atapa el ARN guía se asocia con la enzima Cas9. Este ARN guía es específico por  complementariedad y se hibridará en esa secuencia (la que nos interesa editar o corregir). Entonces actúa Cas9, que es una enzima endonucleasa cortando el ADN. Básicamente podemos decir que el ARN guía actúa de perro lazarillo llevando a Cas9, el ejecutor, al sitio donde ha de realizar su función.

•       En la segunda etapa se activan al menos dos mecanismos naturales de reparación del ADN cortado. El primero llamado indel (inserción-deleción) hace que, después del sitio de corte aparezca un hueco en la cadena o se inserte un trocito más de cadena. Esto conlleva a la perdida de la función original del segmento de ADN cortado. Un segundo mecanismo permite la incorporación de una secuencia concreta exactamente en el sitio original de corte.  Para esto, lógicamente, hemos de darle a la célula la secuencia que queremos que se integre en el ADN.

CRISP/Cas13

Supone una edición de bases del ARN. Interviene Cas13, una enzima que actúa sobre el ARN, en lugar de la habitual Cas9, que actúa en el ADN.

Los avances recientes han llevado al revelado del sistema CRISPR-Cas13, que actúa sobre el ARN mensajero. Puesto que las claves del ARN para la serie de los ácidos nucleicos producidos, corrigiendo la serie del ARN pueden por lo tanto corregir temporalmente la expresión génica sin los riesgos serios asociados a los cambios permanentes al genoma.

Esto se podía utilizar en el tratamiento de enfermedades agudas y la reducción temporal en la inflamación durante el trasplante del órgano. Además de los papeles terapéuticos posibles, el sistema CRISPR-Cas13 puede también ofrecer discernimientos en el ARN que tramita en enfermedad, por ejemplo ARN que corrige y que empalma alternativo.

Puesto que los cambios a los niveles del gen son solamente transitorios, éste permite que los científicos investiguen el gen posible golpea las salidas que podrían curar enfermedad. Los niveles del ARN se pueden volver a normal una vez que el sistema CRISPR-Cas13 se quita de la célula. Debido a esto los cambios no serían pasados sobre los descendientes.

El modo de actuación es:

•       Convierte una adenina (A) en inosina (I), la cual es interpretada como guanina (G) por la maquinaria celular de síntesis de proteínas.

•       Ello permite reparar temporalmente una mutación causante de una enfermedad sin alterar de forma permanente el genoma.

•       Opción que puede resultar más segura, cuando se trata de terapias correctoras de genes.

•       Aunque, implicaría administrar el tratamiento de modo repetido.